美國(guó)Biostone塞尼卡谷測(cè)試劑盒
AsurDxTM Senecavirus A (SVA) Antibody Test Kit
一、概述
試劑盒用于檢測(cè)豬血清或者血漿中Senecavirus A A (SVA)體。試劑盒原理是基于間接ELISA方法，酶標(biāo)板上已經(jīng)包被SVA蛋白重組原，添加樣品后，樣品內(nèi)的體能與板上包被原特異性結(jié)合形成原體復(fù)合物，并與后面加入的酶標(biāo)二結(jié)合，二上的酶再催化底物顯色，顯色深度與樣品中的體含量成正相關(guān)。
二、試劑盒規(guī)格及組分
試劑盒組分 | 10039-02 | 10039-05 | 儲(chǔ)存溫度 |
原包被板SVA antigen-Coated Plate | 2*96 | 5*96 | 4°C |
陽(yáng)性對(duì)照（紅蓋） Positive Control | 2管 | 5管 | 4°C |
陰性對(duì)照（白蓋） Negative Control | 0.2mL | 0.5mL | 4°C |
酶標(biāo)二HRP-Conjugated Antibody Solution | 24mL | 58mL | 4°C |
10X稀釋液10X Diluent Solution | 12mL | 28mL | 4°C |
檢測(cè)稀釋液 Assay Diluent | 20mL | 50mL | 4°C |
20X洗板液 20X Wash Solution | 56mL | 120mL | 4°C |
T底物 T Substrate | 24mL | 58mL | 4°C |
終止液 S Solution | 24mL | 58mL | 4°C |
備注：如果試劑盒過(guò)一個(gè)月不使用建議性對(duì)照和酶標(biāo)二-20°C儲(chǔ)存。
三、試劑以及樣品制備
1X稀釋液：用9體積的蒸餾水稀釋1體積的10X稀釋液，得到1X稀釋液。
1X洗板液：用19體積的蒸餾水稀釋1體積的20X洗板液，得到1X洗板液。
樣品血清/血漿預(yù)稀釋：在血清稀釋板上使用1X稀釋液將樣品血清稀釋10倍，例如將20uL的血清加入到180uL的1X稀釋液中混勻，備用。
陽(yáng)性對(duì)照：取出回溫30分鐘后，每管加入65ul 1X稀釋液，振蕩混勻后備用，不使用時(shí)放于-20°C儲(chǔ)存，反復(fù)凍融應(yīng)不多于3次。
四、實(shí)驗(yàn)操作
試劑 | 每孔用量 |
檢測(cè)稀釋液 | 90 ul |
樣品/對(duì)照 | 10 ul |
酶標(biāo)二 | 100 ul |
1X洗板液 | 2 ml |
底物 | 100 ul |
終止液 | 100 ul |
1. 實(shí)驗(yàn)前1小時(shí)將試劑盒從冰箱中取出回復(fù)室溫；
2. 設(shè)置好對(duì)照及樣品在原包被板的位置，孔中加入90ul 檢測(cè)稀釋液；
3. 加入10ul的陽(yáng)性對(duì)照到原包被板兩個(gè)孔中；
4. 加入10ul的陰性對(duì)照到原包被板的另外兩個(gè)孔中；（將陰性和陽(yáng)性對(duì)照血清分隔加入，例如左上方加陽(yáng)性對(duì)照，右下方加陰性對(duì)照）
5. 其他孔加入10ul預(yù)稀釋的血清樣品（已經(jīng)預(yù)稀釋了1:10）.
6. 輕微振蕩1分鐘；
7. 封板，25°C孵育45分鐘；（注意避免陽(yáng)光直射和空氣進(jìn)入板中）
8. 棄去板中的液體；
9. 每孔加入250ul洗滌液洗板5次，請(qǐng)把板孔拍干；
10. 每孔加入100uL酶標(biāo)二，封板，25°C暗處孵育30分鐘；
11. 每孔加入250ul洗滌液洗板3次，請(qǐng)把板孔拍干；
12. 每孔加入100uL的T底物，室溫下暗處孵育20分鐘；
13. 每孔加入100uL終止液，然后酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)；
五、結(jié)果判斷
樣品PP值=（樣品OD值÷陽(yáng)性對(duì)照OD值）*100
性：陰性對(duì)照的PP值須小于40%，陽(yáng)性對(duì)照OD值的平均值須≥0.7
陰性：樣品的PP值小于40%，樣品血清中體陰性
陽(yáng)性：樣品的PP值大于40%，樣品血清中體陽(yáng)性
六、 問(wèn)題與解決
1.標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)顏色變化或者無(wú)相應(yīng)數(shù)值
可能原因 | 解決方法 |
試劑使用順序混亂，或者操作步驟出錯(cuò)。 | 遵循實(shí)驗(yàn)說(shuō)明重復(fù)實(shí)驗(yàn)。 |
使用了失效的酶標(biāo)原， | 酶標(biāo)原來(lái)自同一試劑盒，同一批次 |
T底物失效。 | 使用新的T底物。 |
2.低吸光度（OD值）
可能原因 | 解決方法 |
試劑過(guò)期，或者不同的批次混用。 | 查證過(guò)期試劑和批次。 |
洗液配制錯(cuò)誤。 | 使用試劑盒提供的洗液，正確配制。 |
過(guò)多次洗滌。 | 按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行洗滌。 |
孵育時(shí)間過(guò)短。 | 按照說(shuō)明書(shū)要求，嚴(yán)格計(jì)算好時(shí)間。 |
實(shí)驗(yàn)室溫度過(guò)低。 | 保持實(shí)驗(yàn)室溫度在（22.5±2.5）°C不要在空調(diào)風(fēng)口或者寒冷的窗戶(hù)旁進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 |
試劑或者微孔板溫度過(guò)低。 | 試劑或者微孔板回溫，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑放置盒子外少1小時(shí)。 |
使用錯(cuò)誤波長(zhǎng)讀數(shù)，或者酶標(biāo)儀失靈。 | 450nm波長(zhǎng)讀數(shù)，檢查酶標(biāo)儀。 |
試劑盒處于端的條件。 | 檢查試劑盒從冰箱拿出使用的次數(shù)，檢查試劑盒是否放置端溫度（過(guò)冷或者過(guò)熱）時(shí)間太長(zhǎng)。 |
酶標(biāo)板損壞 | 酶標(biāo)板一直放置于有干燥劑密封的鋁箔袋中置于冰箱保存，回溫時(shí)也是放于鋁箔袋回到室溫。 |
3.過(guò)高的背景值或吸光度（OD值）
可能原因 | 解決方法 |
使用了質(zhì)量差的水。 | 如果使用的水可疑，嘗試使用蒸餾水配制洗液。 |
底物失效。 | 加入微孔板前，底物是無(wú)色的。 |
洗滌不當(dāng)或者洗板機(jī)洗板效果不好。 | 采用說(shuō)明書(shū)建議的洗滌次數(shù)，每次每孔至少加入250μL洗液。檢查洗滌系統(tǒng)，排除故障。 |
酶標(biāo)儀失靈。如果OD值讀數(shù)很高而顏色很淺，那個(gè)這是可能的情況。 | 使用校正微孔板檢查酶標(biāo)儀，檢查光源。 |
實(shí)驗(yàn)室溫度過(guò)高。 | 保持實(shí)驗(yàn)室溫度（22.5±2.5）°C，避免在熱源或者陽(yáng)光直射處實(shí)驗(yàn)。 |
試劑混淆，被污染或者配制不當(dāng)。 | 使用正確的試劑，準(zhǔn)確配制，避免污染。 |
